布拉德福蛋白質定量法
布拉德福蛋白質定量法(Bradford protein assay),亦稱作「考馬斯亮藍法」、「考馬斯藍染色法」(coomassie blue staining),為一種利用光譜學技術分析溶液中蛋白質濃度的技術。本定量法會受待測胺基酸序列影響,此方法為Marion M. Bradford醫生所開發。
原理
布拉德福蛋白質定量法為一種利用比色法測定蛋白質濃度的化驗法。考馬斯亮藍G-250在酸性環境下,會從紅色型態轉為藍色型態,並與蛋白質緊密結合。在形成這個複合物的過程中會經歷兩種反應:紅色態的考馬斯亮藍會先將其自由電子丟給蛋白質的可電離區,造成蛋白質構型改變,並暴露其疏水性區段。於是蛋白質的三級結構會以凡得瓦力與染劑結合。此外,染劑中的負電區會與蛋白質中的正電區相互結合,與蛋白質結合的考馬斯亮藍會因此穩定其藍色構型,造成溶液顏色改變,此時即可利用光譜儀來測量此變化。
與蛋白結合之後的染料,在一段時間(2 分鐘到 1 小時)之內,其吸收光譜圖在 595 nm 處有一個最大吸收峰。[1] 染料在與蛋白結合前,以陽離子形態存在,顯紅色或者綠色;與蛋白結合之後,染料分子的陰離子形態被穩定,顯藍色。染料的吸收光譜在 595 nm 處的吸收峰的增加,正比於結合了蛋白質的染料分子數目,故也正比於樣品中蛋白質的數目(濃度)。
布拉德福蛋白質定量法與其它測量蛋白的方法不同,不容易受到蛋白質中其它化學成分的影響。
缺點
此章節需要擴充。 (2017年10月27日) |
此蛋白質分析法會受幾種洗滌劑和中性鹽的干擾,如SDS,Triton。 結果也取決於所分析蛋白質中胺基酸的種類。
實驗方法
實驗器材
實驗步驟(標準分析,濃度:200-1500 µg/mL)
- 準備一純蛋白質(通常以牛血清蛋白)溶於0.15 M 氯化鈉溶液中,稀釋濃度為250、500、750和1500 µg/mL。並同時以同濃度稀釋待測蛋白質。
- 在每個試管加入 100 µL 的稀釋蛋白質
- 加入 5.0 mL 的考馬斯亮藍G-250到各試管並混合均勻。
- 將光譜儀波長調整至 595 nm,並以無蛋白質的一管作為基準。
- 5分鐘後測量各試管在 595 nm 下的吸光值
- 畫出標準曲線,計算其吸光係數,並推估蛋白濃度
實驗步驟(微量分析,濃度1-10 µg/mL)
替代化驗法
其他替代蛋白質化驗法還有:
參考文獻
- ^ Bradford, M. Marion. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 1976, 72 (1-2): 248-254 [2015-04-16]. PMID 942051. doi:10.1016/0003-2697(76)90527-3. (原始內容存檔於2019-06-14).
- Zor, T.; Selinger, Z., Linearization of the Bradford protein assay increases its sensitivity: theoretical and experimental studies, Anal. Biochem., 1996, 236: 302–308, PMID 8660509, doi:10.1006/abio.1996.0171
- Noble, J.E.; Bailey, M.J.A., Quantitation of Protein, Methods Enzymol., 2009, 463: 73–95, doi:10.1016/S0076-6879(09)63008-1
- Albright, Brian, Mathematical Modeling with Excel: 60, 2009, ISBN 978-0763765668
- Stephenson, Frank Harold, Calculations for molecular biology and biotechnology: a guide to mathematics in the laboratory: 252, 2003, ISBN 0126657513
- Dennison, Clive, A guide to protein isolation, Focus on structural biology, 2003, 3: 39, ISBN 1402012241
- Ibanez, Jorge G., Environmental chemistry: fundamentals: 60, 2007, ISBN 0387260617