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酶譜法

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諾氏瘧原蟲天冬酰胺內肽酶印記.[1]

酶譜法酶譜英語:Zymography)是一種基於的底物庫來檢測水解酶凝膠電泳技術。使用三種類型的酶譜法;凝膠酶譜法原位酶譜法體內酶譜法中。[2]例如,嵌入聚丙烯酰胺凝膠中的明膠將被凝膠中運行的活性明膠酶消化。考馬斯亮藍染色後,退化區域在深色染色背景下顯示為清晰的條帶。[3]

酶譜一詞的現代用法已經被用來定義發酵產品的研究和編目,例如啤酒葡萄酒,通常由特定的釀酒師或在確定的發酵類別中進行,例如使用特定的酵母菌株或細菌種類。酶譜也指相關的發酵產品的集合,被視為一個作品集。例如,特定啤酒廠生產的所有啤酒都可以統稱為其酶譜。

另見酶學(又稱酶譜應用科學)。酶學涉及發酵的生化過程,特別是釀造、釀酒和其他發酵食品中發酵酵母和細菌的選擇。例如,啤酒釀造涉及應用頂部(淡啤酒)或底部發酵酵母(啤酒),以生產所需的各種啤酒。酵母的合成會影響啤酒的風味特徵,即雙乙酰(黃油、奶油糖果的味道或香氣)。

凝膠酶譜法

用於SDS-PAGE的樣品將在標準非還原加載緩衝液中製備。在這過程中不需要還原劑或將其煮沸,因為它們會干擾酶的重新摺疊。在丙烯酰胺凝膠的製備過程中,將合適的底物(例如用於蛋白酶檢測的明膠酪蛋白)包埋在分離膠中。電泳後,通過在未緩衝的曲拉通X-100中孵育從而將凝膠(或酶譜)中的十二烷基硫酸鈉去除,然後在適當的消化緩衝液中孵育,以便在37°C下的最佳時間長度孵育。隨後對酶譜進行染色(通常使用氨基黑10B考馬斯亮藍),消化區域顯示為清晰的條帶,而底物已被酶降解的則呈現深色染色背景。

標準協議的變體

標準方案可能需要根據樣品酶進行修改;例如,黑腹果蠅消化糖苷酶通常在還原條件下(即存在2-巰基乙醇二硫蘇糖醇)以及在一定程度上加熱條件下存活。事實上,加熱到50°C後的分離往往會表現出條帶解像度的顯着增加,而沒有明顯的活性損失。[4][5]

過去用於α-澱粉酶活性酶譜分析的常用方案也就是所謂的W.W.多恩澱粉膜方案。這裏運行天然PAGE凝膠以分離勻漿中的蛋白質。隨後,將其中溶解(或更準確地說,懸浮)澱粉的薄凝膠覆蓋在原始凝膠上一段時間。[6]然後用盧戈氏碘液澱粉染色。

凝膠酶譜通常用於檢測和分析微生物產生的酶。[7]這導致了標準協議的變化,例如混合底物酶譜法。[8]

反向酶譜將底物和酶與丙烯酰胺共聚,可用於證明酶抑制劑的活性。染色後,抑制區域可視化為透明(或輕微染色)背景下的暗條帶。

在印記技術中,酶通過非變性凝膠電泳分離,凝膠置於底物處理過的洋菜上。[9]

酶譜法也可應用於其他類型的酶,包括木聚糖酶脂肪酶幾丁質酶

參見

參考資料

  1. ^ Hempelmann, E.; Putfarken, B.; Rangachari, K.; Wilson, R.J.M. Immunoprecipitation of malarial acid endopeptidase. Parasitology. 1986, 92 (2): 305–312. PMID 3520446. doi:10.1017/S0031182000064076. 
  2. ^ Vandooren J, Geurts N, Martens E, Van den Steen PE, Opdenakker G. Zymography methods for visualizing hydrolytic enzymes. Nat Methods. 2013, 10 (3): 211–220. PMID 23443633. S2CID 5314901. doi:10.1038/nmeth.2371. 
  3. ^ Gelatin zymography protocol | Abcam. www.abcam.com. [2017-05-12]. (原始內容存檔於2023-02-22) (英語). 
  4. ^ Martínez TF, Alarcón FJ, Díaz-López M, Moyano FJ. Improved detection of amylase activity by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis with copolymerized starch.. Electrophoresis. 2000, 21 (14): 2940–2943. PMID 11001307. doi:10.1002/1522-2683(20000801)21:14<2940::AID-ELPS2940>3.0.CO;2-S. 
  5. ^ Snoek-van Beurden PA, Von den Hoff JW. Zymographic techniques for the analysis of matrix metalloproteinases and their inhibitors. BioTechniques. 2005, 38 (1): 73–83. PMID 15679089. doi:10.2144/05381RV01可免費查閱. 
  6. ^ Doane WW. Amylase variants in Drosophila melanogaster: linkage studies and characterization of enzyme extracts. J Exp Zool. 1969, 171 (3): 31–41. PMID 5348624. doi:10.1002/jez.1401710308. 
  7. ^ Lantz MS, Ciborowski P. Zymographic techniques for detection and characterization of microbial proteases.需要免費註冊. Methods Enzymol. Methods in Enzymology. 1994, 235: 563–594. ISBN 9780121821364. PMID 8057927. doi:10.1016/0076-6879(94)35171-6. 
  8. ^ 引用錯誤:沒有為名為vandoorenetal2的參考文獻提供內容
  9. ^ 引用錯誤:沒有為名為Hempelmann2的參考文獻提供內容