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酶抑制劑

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通常結合底物的一個酶結合位點可以替代地結合競爭性抑制劑，防止底物進入。 二氫葉酸還原酶被甲氨蝶呤抑制，其阻止其底物葉酸的結合。 結合位點為藍色，抑制劑為綠色，底物為黑色。 (PDB 4QI9)

酶抑制劑（英語：Enzyme inhibitor）是一類可以與酶結合併降低其活性的分子。 由於阻斷酶的活性可以殺死病原體[1]或糾正代謝失衡，許多藥物都是酶抑制劑[2][3]。 它們也用於殺蟲劑。 並非所有與酶結合的分子都是抑制劑; 酶激活劑與酶結合併增加其酶活性，而酶底物結合併在酶的正常催化循環中轉化為產物。

一種抑制劑的結合可以阻止底物進入酶的活性位點和/或阻止酶催化其反應。 抑制劑結合是可逆的或不可逆的。 不可逆抑制劑通常與酶反應並化學改變（例如通過共價鍵形成）。 這些抑制劑修飾酶活性所需的關鍵氨基酸殘基。 相反，可逆抑制劑非共價結合，並且取決於這些抑制劑是否與酶，和/或酶－底複合物或兩者結合，產生不同類型的抑制。

由於抑制特定酶的活性可以殺死病原體或校正新陳代謝的不平衡，許多藥物分子都是酶抑制劑，它們的發現和改進是生物化學和藥理學研究的一個活躍領域。評判一個藥用酶抑制劑通常以它的特異性（不與其他蛋白質結合）及效價（解離常數，表示抑制酶所需的濃度）為指標。高特異性和高效價使藥物具有更小的副作用，因而具有更低的毒性。一些酶抑制劑還被用作除草劑或農藥。

酶抑制劑天然存在並參與代謝調節。例如，代謝途徑中的酶可被下游產物抑制。當產物開始積聚時，這種負反饋會減慢生產的速度，並有助於維持細胞穩態。也有的細胞酶抑制劑是特異性結合併抑制標靶酶的蛋白質。這可以幫助控制可能對細胞有害的酶，如蛋白酶和核酸酶。一個典型例子是核糖核酸酶抑制劑，它可以與核糖核酸酶結合，是已知最緊密的蛋白質－蛋白質相互作用之一。天然酶抑制劑也可以作為毒藥，用以防禦食肉動物或殺死獵物。

可逆性抑制劑

可逆抑制劑通過非共價相互作用附着於酶，例如氫鍵，疏水相互作用和離子鍵。抑制劑和活性位點之間的多個弱鍵結合產生緊密的特異性結合。與底物和不可逆抑制劑相反，可逆抑制劑在與酶結合時通常不發生化學反應，並且可以通過稀釋或透析很容易地除去。

分類

可逆性抑制劑可以根據改變底物濃度對抑制劑的影響分為四種。

不同的抑制類型。分類參考自[4]。圖中，「E」表示酶（Enzyme）；「I」表示抑制劑（Inhibitor）；「S」表示底物（Substrate）；「P」表示產物（Product）；「ES」表示酶－底物複合物（E-S Complex）。

競爭性抑制劑

競爭性抑制劑（英語：Competitive inhibitor）在結構上通常與底物相似。它和底物不能同時與酶結合，通常是由於它對酶的活性位點具有親和力，而底物也與該位點結合，故底物和抑制劑競爭結合酶的活性位點。這種類型的抑制可以通過提高底物濃度，即與抑制劑競爭來克服（此時最大反應速度Vmax保持不變）。然而，表觀米氏常數Km（反應速度達到Vmax一半時的底物濃度）將增加，因為需要更高的底物濃度才能達到一半的最大反應速度。[5]

非競爭性抑制劑

非競爭性抑制劑（英語：Non-competitive inhibitor）通常與酶的非活性部位結合，降低酶的活性，但不影響酶與底物結合。故該抑制劑對反應的抑制程度取決於抑制劑的濃度。由於反應不能有效進行，Vmax將降低，但Km值將保持不變。[5]這是因為Km是酶與底物親和力的量度，只能通過活性酶來測量。非競爭性抑制中固定量的無活性酶不影響Km，因此不變。[6][7][8]

反競爭性抑制劑

反競爭性抑制劑（英語：Uncompetitive inhibitor）僅與酶－底物複合物結合，導致最大反應速度Vmax因酶－底物複合物被去除而降低。且由於複合物被去除，根據勒夏特列原理可得出酶與底物的結合速率會變快，因此Km值也會降低，酶與底物表現出更高的親和力。[5]在反應中Vmax和Km的比值均會變小。反競爭性抑制劑在底物濃度高時效果很好。

複合抑制劑

複合抑制劑（英語：Mixed inhibitor）可以與酶的底物同時結合酶。然而，抑制劑的結合影響底物的結合，反之亦然。這種類型的抑制可以被克服，但不能通過增加底物濃度來克服。儘管複合抑制劑可能與酶的活性位點結合，但這種類型的抑制通常是由抑制劑結合酶上的多個位點而產生的變構效應導致。抑制劑與該變構位點的結合改變了酶的構象，從而降低了底物對活性位點的親和力。

可逆性抑制劑的定量描述

可以根據抑制劑與酶和酶－底物複合物的結合及其對酶的動力學常數的影響來定量描述可逆抑制。在下面的經典米氏動力學模型中，酶（E）與其底物（S）結合以形成酶－底物複合物（ES）。催化後，該複合物分解釋放產物（P）和游離酶。抑制劑（I）可以分別以解離常數Ki或Ki′結合E或ES。

可逆酶抑制劑的動力學模型
  • 競爭性抑制劑可以與E結合，但不與ES結合。競爭性抑制增加Km（抑制劑干擾底物結合），但不影響Vmax（抑制劑不能與ES結合，足夠多的底物仍可使反應達到原最大速度）。
  • 非競爭性抑制劑對E和ES具有相同的親和力（Ki = Ki′）。非競爭性抑制不改變Km（抑制劑不影響底物結合），但降低Vmax（抑制劑與ES的結合阻礙催化作用）。
  • 反競爭性抑制劑與ES結合，同時降低Km（提高酶與底物親和力）和Vmax（阻礙催化作用），二者比值保持不變。
  • 複合抑制劑與E和ES結合，但它們對二者的親和力是不同的（Ki ≠ Ki′）。複合抑制劑干擾底物結合（增加Km）並阻礙ES複合物中的催化作用（降低Vmax）。

當酶具有多種底物時，抑制劑可以根據所抑制的底物表現不同類型的抑制。這是由於活性位點內含有不同的結合位點產生的，每個底物對應一個。例如，某抑制劑可能與底物A競爭第一個結合位點，但在第二個結合位點是底物B的非競爭性抑制劑。

解離常數測量

如上所述，酶抑制劑的特徵在於對酶和酶－底物複合物的兩個解離常數Ki和Ki′。酶抑制劑常數Ki可以通過各種方法直接測量：一種極其準確的方法是等溫滴定量熱法，這種方法將抑制劑滴定到酶溶液中並測量釋放或吸收的熱量以測定解離常數。[9]然而，解離常數Ki′難以直接測量，因為酶－底物複合物的存在時間較短，並且易發生生成酶與產物的化學反應。因此，Ki′通常通過觀察各種底物和抑制劑濃度下的酶活性，並將數據[10]擬合到稍有改動的米氏動力學方程

中間接測量，其中修飾因子α和α′由抑制劑濃度和它的兩個解離常數

來定義。

因此，在抑制劑存在下，酶的有效Km和Vmax分別變為（α/α′）Km和（1/α′）Vmax。然而，改動的米氏動力學方程假定抑制劑與酶的結合已達到平衡，這對於具有亞納摩爾級別解離常數的抑制劑可能是非常緩慢的過程。在這些情況下，將緊密結合的抑制劑作為不可逆抑制劑通常更為實際（參見下文）；然而，如果Ki是獨立測量的，那麼仍然可以動態地估計Ki′。

可以使用米氏動力學方程的圖象表示來顯示不同類型的可逆酶抑制劑對酶活性的影響，例如雙倒數圖和Eadie-Hofstee圖象。然而，從這些圖中準確估計Ki和Ki′可能很困難[11] ，因此使用非線性回歸方法估算這些常數更為可靠，如上所述。

不可逆性抑制劑

不可逆抑制的類型（共價失活）

不可逆抑制劑二異丙基氟磷酸鹽（英語：Diisopropyl fluorophosphate）（DFP）與絲氨酸蛋白酶的反應

不可逆抑制劑通常通過與酶形成共價鍵來抑制酶的活性，因此這種抑制不能逆轉。不可逆抑制劑通常含有活性官能團，例如氮芥，醛，鹵代烷，烯烴，米高受體，苯磺酸鹽，MAFP等。這些親電體與氨基酸側鏈反應形成共價加合物，修飾含親核體（如羥基或巰基）側鏈的殘基，包括氨基酸絲氨酸(見右側圖)，半胱氨酸，蘇氨酸，酪氨酸等[12]。

不可逆抑制不同於不可逆的酶失活(enzyme inactivation)。 不可逆抑制劑通常對一類酶具有特異性，不會使所有蛋白質失活; 它們不通過破壞蛋白質結構而是通過特異性改變其靶標的活性位點起作用。 例如，極端的pH或溫度通常會導致所有蛋白質結構的變性，但這是非特異性的影響。 同樣，一些非特異性的化學處理會破壞蛋白質結構：例如，在濃鹽酸中加熱會使保持蛋白質的肽鍵水解，釋放游離的氨基酸[13]。

不可逆抑制劑顯示出時間依賴性抑制，因此其效力不能通過IC50值表徵。 這是因為在給定濃度的不可逆抑制劑下活性酶的量將根據抑制劑與酶預孵育的時間而不同。 相反，kobs/[I]值被使用[14]，其中kobs是被觀察到的偽一階失活速率（通過繪製％活性對時間的對數圖得到），[I]是抑制劑的濃度。 只要抑制劑不與酶結合（在這種情況下kobs = kinact），kobs/[I]參數就是有效的。

不可逆抑制的分析

不可逆抑制劑的動力學方案

如右圖所示，不可逆抑制劑與酶（EI或ESI）形成可逆的非共價複合物，然後反應產生共價修飾的"末端複合物(dead-end complex)"EI*。 EI*形成的速率稱為失活速率或kinact。 由於EI的形成可能與ES競爭，因此可通過與底物或第二種可逆抑制劑競爭來預防不可逆抑制劑的結合。 這種保護作用是不可逆抑制劑與活性位點特異性反應的良好證據。

通過將酶與抑制劑一起孵育並測定隨時間保留的活性量來研究該反應的結合和失活步驟。 活動將以時間依賴的方式減少，通常跟隨指數衰減。 將這些數據擬合至速率方程，給出該抑制劑在這個濃度下的失活速率。 這是在抑制劑的幾種不同濃度下完成的。 如果一個可逆的EI複合物被涉及，則失活率將是可飽和的，並且擬合該曲線將給出kinact和Ki</sub [15]。

在這些分析中廣泛使用的另一種方法是質譜法。 在這裏，準確測量未修飾的天然酶和滅活酶的質量會使與抑制劑反應引起的質量增加，並顯示反應的化學計量[16]。 這通常使用基質輔助激光解吸/電離-TOF(MALDI-TOF)質譜儀完成。在一個互補技術中，肽質量指紋識別（英語：Peptide mass fingerprinting）涉及用蛋白酶如胰蛋白酶消化天然的和修飾的蛋白質。 這將產生可以使用質譜儀分析的一組肽。 與抑制劑反應後質量變化的肽將是含有修飾位點的肽。

發現與設計

用於高通量篩選化合物庫以發現新化合物的機械人。

新的藥物是長期藥物研發過程中的產物，而發現新藥的第一步往往是發現新的酶抑制劑。在過去，發現新抑制劑的唯一途徑是反覆實驗：篩選大量的化合物對抗靶酶 ，並希望出現一些有效的引物。這種暴力的方法仍然是成功的，甚至通過組合化學方法擴展，快速生產大量的新化合物，並使用高效篩選技術快速篩選這些巨大的化合物庫來尋找有效的抑制劑。[17]

最近，一種新方法被廣泛應用：合理藥物設計利用酶活性位點的三維結構來預測哪些分子可能是抑制劑。[18]對這些預測出的化合物進行測試，新型抑制劑就可能會從這些化合物中產生。然後，對這種抑制劑與酶形成的抑制劑—酶複合物進行測試並獲得酶的結構，以顯示分子如何與活性位點結合，從而可以對抑制劑進行修改以優化其與酶的結合。重複該測試和改進，直到產生足夠有效的抑制劑。[19]使用計算機預測酶抑制劑親和力的方法也正在開發中，例如分子對接和分子力學。

應用

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酶抑制劑存在於自然界中，並且還作為藥理學和生物化學的一部分設計和生產。 天然毒物通常是酶抑制劑，其已經進化以保護植物或動物免受捕食者的侵害。 這些天然毒素包括一些已知的毒性最強的化合物。 人工抑制劑通常用作藥物，但也可以是殺蟲劑，如馬拉硫磷，除草劑，如草甘膦，或消毒劑，如三氯生。 其他人工酶抑制劑可阻斷乙酰膽鹼酯酶，這是一種分解乙酰膽鹼的酶，可用作化學戰中的神經毒劑。

化學治療

西地那非的結構
輔酶葉酸（左）與抗癌藥物甲氨蝶呤（右）相比較
青黴素G和'鏈黴菌'轉肽酶之間複合物的結構。從 PDB 1PWC （頁面存檔備份，存於互聯網檔案館）生成。

酶抑制劑最常見的用途是作為治療疾病的藥物。 許多這些抑制劑靶向人酶並且旨在糾正病理狀況。 然而，並非所有藥物都是酶抑制劑。 一些例如抗癲癇藥物通過引起或多或少的酶產生來改變酶活性。 這些作用被稱為酶誘導和抑制（英語：Enzyme induction and inhibition），並且是基因表達的改變，這與本文討論的酶抑制類型無關。 其他藥物與不是酶的細胞靶標相互作用，例如離子通道或膜受體。

藥用酶抑制劑的實例是西地那非，其是男性勃起功能障礙的常見治療方法。 該化合物是cGMP特異性磷酸二酯酶5型（英語：cGMP specific phosphodiesterase type 5）的有效抑制劑，該酶降解信號分子環磷酸鳥苷[20]。 這種信號分子觸發平滑肌鬆弛，並允許血液流入陰莖海綿體，從而引起勃起。 由於藥物降低了停止信號的酶的活性，因此它使該信號持續更長的時間。

另一個實例一些抑制劑與它們靶向的酶底物結構相似性在圖中可以被看到，比較藥物甲氨蝶呤與葉酸。 葉酸是二氫葉酸還原酶的底物，二氫葉酸還原酶是一種參與製備被甲氨蝶呤有效抑制的核苷酸的酶。 甲氨蝶呤阻斷二氫葉酸還原酶的作用，從而停止核苷酸的產生。 這種核苷酸生物合成塊對快速生長的細胞比非分裂細胞毒性更大，因為快速生長的細胞必須進行DNA複製，因此甲氨蝶呤經常用於癌症的化學療法[21]。

抗生素

藥物也被用於抑制病原體存活所需的酶[1][2][7][8][3]。 例如，細菌被稱為肽聚糖的網狀聚合物製成的厚細胞壁包圍。 許多抗生素如青黴素和萬古黴素可以抑制產生這種聚合物鏈的酶，然後將這些聚合物交聯在一起[22]。 這導致細胞壁失去強度並且細菌破裂。 在該圖中，顯示青黴素分子（以球-棒形式顯示）與其靶標結合，來自細菌鏈黴菌R61的轉肽酶（蛋白質被顯示為帶狀圖）。

當對病原體存活至關重要的酶在人體中不存在或非常不同時，促進抗生素藥物設計。 在上面的例子中，人類不製備肽聚糖，因此該過程的抑制劑對細菌具有選擇性毒性。 通過利用細菌中核糖體結構的差異或它們如何產生脂肪酸，抗生素也產生選擇性毒性。

代謝控制

酶抑制劑在代謝控制中也很重要。 細胞中的許多代謝途徑被通過變構調節或底物抑制來控制酶活性的代謝物抑制。一個很好的例子是糖酵解途徑的變構調節。該異化作用途徑消耗葡萄糖並產生ATP，NADH，和丙酮酸。 調節糖酵解的關鍵步驟是磷酸果糖激酶-1（英語：Phosphofructokinase）（PFK1）催化的途徑中的早期反應。 當ATP水平升高時，ATP結合PFK1中的變構位點以降低酶反應的速率; 糖酵解受到抑制，ATP產生下降。 這種負反饋控制有助於維持細胞中ATP的穩定濃度。 然而，代謝途徑不僅僅通過抑制來調節，因為酶活化同樣重要。 關於PFK1，果糖2,6-二磷酸（英語：Fructose 2,6-bisphosphate）和ADP是變構活化劑的代謝物的例子[23]。

農藥

許多農藥都是酶抑制劑。 乙酰膽鹼酯酶（AChE）是從昆蟲到人類的動物中發現的酶。 通過其將神經遞質乙酰膽鹼分解成其成分，乙酸和膽鹼的機制，神經細胞功能是必不可少的。 這在神經遞質中有點不尋常，因為大多數，包括血清素，多巴胺和去甲腎上腺素，都是從突觸間隙吸收而不是切割。 大量的AChE抑制劑用於醫藥和農業。 可逆的競爭性抑制劑，例如，edrophonium，毒扁豆鹼和新斯的明，用於治療重症肌無力和麻醉。 氨基甲酸酯類農藥也是可逆AChE抑制劑的實例。 有機磷農藥如馬拉硫磷，對硫磷和毒死蜱不可逆地抑制乙酰膽鹼酯酶。

除草劑草甘膦是3-磷酸莽草酸1-羧基乙烯基轉移酶（英語：EPSP synthas）的抑制劑[24]，其他除草劑，如磺酰脲類抑制酶乙酰乳酸合成酶（英語：Acetolactate synthase）。 這些酶都是植物製備支鏈氨基酸所必需的。 許多其他酶被除草劑抑制，包括脂質和類胡蘿蔔素生物合成所需的酶以及光合作用和氧化磷酸化過程[25]。

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參看

外部連結


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